A Doença de Chagas permanece como importante problema de saúde pública nas Américas, tendo o Rhodnius prolixus entre seus principais vetores. Apesar dos avanços nas pesquisas sobre a microbiota bacteriana desses insetos, a microbiota fúngica ainda é pouco conhecida, especialmente em exemplares mantidos em colônias laboratoriais. Este estudo teve como objetivo caracterizar a microbiota fúngica cultivável presente no intestino de Rhodnius prolixus, identificar os gêneros isolados e discutir suas implicações para a vigilância em saúde e para a atuação da Enfermagem. Trata-se de um estudo experimental, descritivo, com abordagem quantitativa e qualitativa, realizado a partir da análise de 27 exemplares adultos provenientes do insetário da Fiocruz. Após a dissecação dos intestinos e cultivo em meios específicos, foram obtidos 15 isolados fúngicos, incluindo os gêneros Aspergillus, Penicillium, Curvularia, Paecilomyces e a espécie Candida spencermartinsiae. Os resultados evidenciaram uma microbiota fúngica diversificada, mesmo em insetos mantidos sob condições controladas, indicando possíveis implicações para a biossegurança, o controle vetorial e a vigilância epidemiológica. Conclui-se que a caracterização dessa microbiota amplia o conhecimento sobre a biologia do vetor e reforça a importância da atuação do enfermeiro nas ações de vigilância em saúde, educação em saúde, biossegurança e prevenção da Doença